חקר המיקרוביום - מבוא חלק 2: השיטות המרכזיות לחקר המיקרוביום

השיטות המרכזיות לחקר המיקרוביום

במאמר Review משנת 2015, סוקרים (1) Mueller ו Sachs את הגישות המרכזיות לחקור את תפקוד ה #מיקרוביום על יתרונותינן וחסרונותיהן. אנחנו נסקור כאן בקצרה את הגישות ובכל סעיף נציג מחקר, המהווה דוגמא לגישת המחקר. דרך הדוגמאות ניתן גם להתרשם ממכלול התופעות בהן נמצאה מעורבות של ה #מיקרוביוטה.

1. הגישה הפשוטה/הבסיסית ביותר היא בחינת מתאם (#Correlational_Analyses) בין הרכב המיקרוביום (הטקסונומי והגנטי) לבריאות המאכסן/פרמטרים שמעידים על טיב התפקוד של המאכסן.

דוגמא:

Altered fecal microbiota composition in patients with major depressive disorder (2)

מחקר שהשווה את הרכב המיקרוביום של חולים שאופינו כסובלים מדכאון (major depressive disorder (MDD)), כאלו שהגיבו לטיפול תרופתי וכאלו שלא, לבין קבוצת ביקורת של בריאים. נמצא שכמה סוגים עיקריים של חיידקים היו שונים באופן מובהק בין החולים לבריאים (קורלציה שלילית בין רמות של אחד הסוגים וחומרת הדיכאון). כלומר, בחולי דכאון היתה נוכחות מוגברת של חיידקים בעלי פוטנציאל מזיק וירידה בחיידקים מועילים (2).

על אף המימצאים המעניינים, המחקר הזה מדגים גם כמה מהבעיות בגישת המחקר. ראשית, השימוש ב PCR כחלק מהתהליך גורם להטיות בהערכת תפוצת המיקרואורגניזמים השונים בדוגמא. כמו כן, גם חיידקים מאד קרובים יכולים להיות שונים מאד ברצפים באזורים פונקציונליים ומכאן בתפקוד שלהם (1). שנית, מעבר להטיות הנובעות מהטכניקה של הניסוי, על סמך תוצאות הרצף בלבד, נשארת שאלת הסיבתיות. האם הרכב המיקרוביום הוא (חלק מ) גורם המחלה או שהוא משתנה עקב המחלה. כלומר שהשינוי במיקרוביום הוא סימפטום של המחלה ולא הגורם שלה.

2. מורכבות הרבה יותר הן גישות #Multi_omics , שבוחנות את הגנום, הטרנסקריפטום, הפרוטאום והמטבולום של כלל אוכלוסית המיקרוביוטה והאינטראקציות בתוכה (Whole-Community #Metagenomics, #Metatranscriptomic, #Metaproteomics and #metabolism) (3).

דוגמא: מחקר רב-היקף כזה, שפורסם לאחרונה, הוא

“Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases” (4).

במחקר עקבו במשך שנה אחרי 132 מטופלים, שחולקו לכאלו שאובחנו על פי מדדים קליניים כסובלים מ inflammatory bowel diseases (IDB)ומולם קבוצת ביקורת של "בריאים". לצד בדיקות ביופסיה ודם של המטופלים, נבחנו דוגמאות צואה אחת לשבועיים, בכמה רמות: ריצוף מטה-גנומי (Whole-genome fragment libraries) של כלל המיקרואורגניזמים בדוגמא; ריצוף של המטה-טרנסקריפטום (mRNA); וירומיקה (#Viromics), כלומר ריצוף של גנום RNA של הוירוסים בדוגמא; המטבולום, פרופיל המטבוליטים בדוגמא; והפרוטאום, אפיון החלבונים/האנזימים בדוגמא. תוצאות המחקר רוכזו במאגר נתוני עתק:

Inflammatory_Bowel_Disease_Multi’omics_Database (http://ibdmdb.org)

ניתוח הנתונים איפשר לזהות שינויים מובהקים במיקרוביום בין חולים לבריאים, שחלקם היו ידועים בעבר וחלקם התגלו במחקר הנוכחי. המבט הכולל ברמת ה "Multi’omics" מאפשר להגדיר כיווני המשך למחקר. לדוגמא, תוצאות המחקר הראו עליה במטבוליטים בחומצות מרה לא קשורות (unconjugated bile acids) וירידה מקבילה של מטבוליטים משניים של חומצות מרה. נכון להיום ידועים רק מספר קטן של מינים לא נפוצים שמתרחשים בהם תהליכי מטבוליזם של חומצות מרה. זיהוי ואפיון של מינים נוספים כאלו מרחיב את האפשרויות של מיקרואורגניזמים שישמשו מטרות לשיקום טיפולי (4). מחברי המאמר מדגישים כי המחקר לא קבע האם השינויים במאפייני ה "Multi’omics" יכולים לשמש כאינדיקטורים להתפתחות מחלה לפני שהיא פורצת. הם מציעים לבחון הלאה את תוצאות המחקר כדי לזהות את השינויים המוקדמים ביותר בפרופילים של חולים לעומת בריאים והאם הם מאפשרים לחזות את התפרצות הסימפטומים של המחלה (4).

בשורה התחתונה, מחקרים כאלו, ברמת ה " Multi’omics", הם מורכבים ויקרים מאד. הם מספקים הרבה מאד נתונים, אבל נכון להיום, יכולות האנליזה של משמעות התוצאות והתמונה הכוללת העולה מהן, עדיין מוגבלות מאד.

3. שיטה ישירה לבדיקת השפעת המיקרוביום על מצבי בריאות וחולי היא ע"י ביצוע שינויים מבוקרים (מניפולציה ניסויית/Experimental Manipulation) של המיקרוביום במאכסן. במחקרים כאלו מקובל להשתמש במאכסנים גנוטוביוטים (בע"ח שידוע לגביהם בדיוק אלו חיידקים יש בהם או שהם נקיים מחיידקים (germ-free)) ולהדביקם עם מיני חיידקים ספציפיים ואפילו החלפה במיקרוביום שלם מיצור אחר. במקרים אחרים נעשה שימוש ב"מודלים למחלה" (בע"ח שפותחו כמודל למחלה מסויימת ומראים את הסימפטומים של המחלה) וריפוי המחלה (או לפחות חלק מהפרמטרים/סימפוטים שלה) ע"י מניפולציה של המיקרוביום שלה.

דוגמא:

Gut microbiota manipulation through probiotics oral administration restores glucose

homeostasis in a mouse model of Alzheimer's disease (5)

המחקר הראה ששינוי המיקרביום של המעי של עכברי מודל לאלצהיימר ע"י נתינה אורלית של פרוביוטיקה, שהכילה הרכב מועשר בחיידקי lactic acid וbifidobacteria , שיפרה את המטבוליזם הלקוי של גלוקוז במחלת האלצהיימר ועיכבה את התקדמות המחלה.

ניסויים כאלו, המראים שחיידקים בעלי פעילות מטבולית ידועה משפיעים על פרמטרים ספציפיים בתפקוד המאכסן, מקדמים גם את פענוח המנגנונים המוקולריים בבסיס מצבי חולי או לחילופין בהגברת עמידות. יחד עם זאת, לפעמים עצם ההתערבות משפיעה על תפקוד המאכסן ולאו דווקא השינוי הספציפי במיקרוביום. כמו-כן, השיטה באופן עקרוני, מוגבלת למיקרובים שניתן לבודד ולגדל בתרבית (1).

4. צעד נוסף באותו כיוון הוא יצירת #מיקרוביום_סינטתי (#Synthetic_Microbiome), כלומר שילוב מתוכנן ומבוקר של מספר נתון (ולא גדול) של זנים ידועים בעלי פונקציות רצויות ושימוש בהם ככלי קליני לשיפור בריאות המאכסן או כמודל פשוט יותר של המיקרוביום בטבע.

דוגמא:

A Synthetic Community Approach Reveals Plant Genotypes Affecting the Phyllosphere Microbiota (6)

שתילי (צמח המודל) ארבידופסיס מזן הבר ומוטנטים הפגועים בתגובה ל"הרעבת פוספאט", שגדלו בתנאים סטריליים, נחשפו להרכב סינטטי אך מורכב של חיידקים ((synthetic bacterial community (SynCom). נמצא שה #SynCom הגביר בצורה משמעותית את תגובת צמחי הבר לרמות נמוכות של פוספאט ואת יכולתם לקלוט פוספאט בתנאים כאלו. עוד נמצא, שהמוטנטים הפגועים בתגובה להרעבת פוספאט, לא אספו סביבם את אותו הרכב חיידקים מתוך ה SynCom כמו זן הבר. בהתאמה לכך, בנוכחות ה SynCom, היה ביטוי שונה של גנים הקשורים לתגובה להרעבת פוספאט בין המוטנטים לזן הבר.

שימוש במיקרוביום סינטטי מגביר עוד יותר את יכולת הבקרה, זיהוי ואפיון זני החיידקים המשפיעים על המאכסן בתנאים הנבדקים וגם לבחון את הגורמים המולקולריים (הגנים, תוצריהם והתהליכים) במאכסן שמשתתפים באינטראקציות עם המיקרוביום. אך גם כאן, הרכב המיקרוביום מוגבל לזנים שקל יחסית לגדל בתרבית ולהעביר לסביבת המאכסן ויש להניח שגם המבנה המרחבי של המיקרוביום יהיה במקרה כזה, שונה מזה של המיקרוביום הטבעי.

5. הנדסת המיקרוביום ע"י בחירה בררנית (רב-שלבית) של המיקרוביום לפי השפעת המיקרוביום על תפקוד המאכסן (Microbiome_Engineering by Artificial Selection on Host–Microbiome Associations). בניסויים כאלו מתחילים בחשיפת המאכסן להרכב מקרוביום התחלתי. בוחנים את הדוגמא שבא תגובת המאכסן היתה הטובה ביותר לתנאים הנבחנים. משתמשים בהרכב המיקרוביום שהתפתח באינטראקציה עם המאכסן בדוגמא הנ"ל לסיבוב מבחן נוסף וכך הלאה.

דוגמא:

Host-mediated #microbiome_engineering (#HMME) of drought tolerance in the wheat rhizosphere (7)

בניסוי מעניין זה, עשו בחירה בררנית של אוכלוסיית מיקרובים, שהעניקה עמידות לעקת יובש בצמחי חיטה. צמחים גודלו בעציצים שהכילו אדמה. לאחר שהצמחים גדלו, העציצים נחשפו לעקת יובש. ה rhizospheres (האדמה ומערכת השורשים) של העציצים, בהם גדלו הצמחים שהראו את העמידות הטובה ביותר לתנאי היובש, נבחרו לשמש כמצע הגידול לדור נוסף וכך במשך 6 מחזורים. ה DNA מה rhizospheres של הסיבוב ההתחלתי, השלישי והשישי, מוצה ועבר ריצוף של ה 16S rRNA על מנת לאפיין את השינויים שהתחוללו במיקרוביום במהלך שלבי הסלקציה ואת הרכב המיקרוביום שיכול להעניק עמידות לעקת יובש.

היתרון הברור של הנדסת מיקרוביום סינטטי בשיטה הזו, הוא שהמיקרוביום יכלול גם זנים שאינם ניתנים לגידול בתרבית. יחד עם זאת, הבחירה הבררנית דורשת מספר (לא מועט) של מחזורי גידול ובירור ולפיכך ניסויים כאלו אורכים זמן רב יחסית.

References

1. 12.Mueller UG, Sachs JL. Engineering Microbiomes to Improve Plant and Animal Health. Trends in Microbiology. 2015;23(10):606-617. doi:10.1016/j.tim.2015.07.009

2. Jiang H, Ling Z, Zhang Y, et al. Altered fecal microbiota composition in patients with major depressive disorder. Brain, Behavior, and Immunity. 2015;48:186-194. doi:10.1016/j.bbi.2015.03.016

3. Zhang X, Li L, Butcher J, Stintzi A, Figeys D. Advancing functional and translational microbiome research using meta-omics approaches. Microbiome. 2019;7(1). doi:10.1186/s40168-019-0767-6

4. Lloyd-Price J, Arze C, Ananthakrishnan AN, et al. Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases. Nature. 2019;569(7758):655-662. doi:10.1038/s41586-019-1237-9

5. Bonfili L, Cecarini V, Gogoi O, et al. Gut microbiota manipulation through probiotics oral administration restores glucose homeostasis in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. November 2019. doi:10.1016/j.neurobiolaging.2019.11.004

6. Bodenhausen N, Bortfeld-Miller M, Ackermann M, Vorholt JA. A Synthetic Community Approach Reveals Plant Genotypes Affecting the Phyllosphere Microbiota. Hentschel U, ed. PLoS Genetics. 2014;10(4):e1004283. doi:10.1371/journal.pgen.1004283

‌7. Jochum MD, McWilliams KL, Pierson EA, Jo Y-K. Host-mediated microbiome engineering (HMME) of drought tolerance in the wheat rhizosphere. Finkel O, ed. PLOS ONE. 2019;14(12):e0225933. doi:10.1371/journal.pone.0225933